有沒有ELISA結(jié)果判讀的常見問題解答

　　ELISA結(jié)果判讀常見問題解答，本生BUNSEN技術(shù)老師驗后的數(shù)據(jù)困惑總結(jié)：

　　一、基礎(chǔ)判定類問題

　　陽性/陰性/不確定結(jié)果分別代表什么??

　　陽性：樣本OD值高于試劑盒設(shè)定的Cut-off臨界值，提示檢出目標(biāo)物;陰性：OD值低于臨界值，未檢出目標(biāo)物;不確定：OD值落在臨界值附近的灰區(qū)，無法直接判定，需重復(fù)檢測或用其他方法驗證。

　　樣本OD值低于空白值，是實驗失敗了嗎??

　　不一定。少量樣本出現(xiàn)該情況多是操作誤差，增加重復(fù)孔即可;大量樣本出現(xiàn)則大概率是基質(zhì)效應(yīng)，可通過稀釋樣本、用含動物血清的PBS配制校正曲線來修正。

　　二、標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)問題

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線R2達不到0.99，還能用嗎??

　　不建議直接使用。R2低于0.98時，所有樣本的濃度計算誤差會明顯增大，優(yōu)先排查標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度是否出錯、移液器是否校準(zhǔn)、復(fù)孔是否有跳點，修正后重新擬合曲線。

　　高濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值反而比低濃度低，是什么原因??

　　這是典型的?鉤狀效應(yīng)，高濃度抗原占據(jù)所有抗體結(jié)合位點，無法形成有效夾心復(fù)合物，信號反而下降，將高濃度樣本梯度稀釋后重新檢測即可恢復(fù)正常。

　　三、異常結(jié)果類問題

　　明明是陰性樣本，卻測出陽性結(jié)果(假陽性)，常見原因有哪些??

　　多由交叉反應(yīng)、樣本溶血/脂血、洗滌不凈、封閉不充分導(dǎo)致，可通過選擇高特異性抗體、離心去除樣本雜質(zhì)、增加洗滌次數(shù)來降低假陽性概率。

　　預(yù)期陽性的樣本測出陰性(假陰性)，該怎么排查??

　　優(yōu)先檢查樣本中目標(biāo)物濃度是否低于檢測限、孵育時間/溫度是否不達標(biāo)、樣本是否反復(fù)凍融破壞了抗原結(jié)構(gòu)，可嘗試濃縮樣本、延長孵育時間重新檢測。

　　整板都出現(xiàn)高背景、全板發(fā)黃，是什么問題??

　　大概率是洗板不充分、底物孵育時間過長、封閉步驟失效，可調(diào)整為每步洗滌5次、底物避光孵育10-15分鐘后及時終止，更換更合適的封閉劑重新實驗。

　　四、實操注意事項

　　不同試劑盒的Cut-off值、參考范圍存在差異，判讀時必須以對應(yīng)試劑盒的說明書為準(zhǔn)。

　　ELISA檢測僅作為初篩手段，陽性結(jié)果需通過Western Blot、hesuan 檢測等方法做最終確認(rèn)。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

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